что такое прямое окрашивание в гистологии

Общие принципы и методы окрашивания гистологических препаратов

код для вставки на форум:

В основе окрашивания клеток и тканей лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах. Большое значение имеют плотность ткани и дисперсность красителя, которые определяют последовательность и скорость окрашивания.

Целью окрашивания является более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей. Некоторые красители обеспечивают этот эффект, растворяясь в выявляемых компонентах, например нейтральных жирах. Другие красители вызывают химическую реакцию, например выявление железа с образованием берлинской лазури в кислой среде. Во многих случаях процесс окрашивания возможен только при наличии протравы, например гематоксилин окрашивает ткань в присутствии солей металлов.

Для получения оптимальных результатов окрашивания гистологических препаратов нужно использовать растворы, приготовленные в точном соответствии с рекомендуемой прописью. Перед приготовлением нужно внимательно осмотреть реактивы, так как возможны изменение цвета, окисление, кристаллизация и т.п. По мере инактивации, разбавления и изменения концентрации растворов красителя при длительном использовании его необходимо своевременно заменять свежим. Для хранения красителей и проведения окраски применяют химически чистую маркированную посуду. После приготовления новых порций красителя, особенно при использовании различных партий реактивов окраску нужно контролировать под микроскопом. Продолжительность окрашивания реактивами различных фирм варьирует.

похожие статьи

Атлас по судебно-медицинской гистологии / Пиголкин Ю.И., Кислов М.А., Должанский О.В., Филиппенкова Е.И., Крупин К.Н. — 2021.

Анализ недостатков судебно-гистологических исследований и пути их устранения / Гедыгушева Н.П., Буланова Э.В. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 47-49.

Возможности установления некоторых причин смерти гистохимическими методами / Смирнов В.В., Смирнов В.В. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 31-32.

Актуальные вопросы гистологического исследования при экспертизе живых лиц / Кулеша Н.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2018. — №17. — С. 125-128.

Источник

Как проводится гистологическое исследование: виды, методы, особенности

Злокачественные новообразования — это группа заболеваний, насчитывающая несколько тысяч видов опухолей разных типов и разной степени злокачественности. Они подразделяются на большие группы в зависимости от того из каких тканей они развиваются: если из эпителиальных (барьерных) — то это раки, если из соединительных тканей (мягких тканей и костей) – саркомы, если из лимфоидных (иммунных) – лимфомы/лейкозы. От того насколько правильно верифицирована опухоль (определен ее тип, степень злокачественности и другие характеристики) зависит правильность и эффективность лечения. Важную роль в этом играют гистологические исследования.

О том, как проходят гистологические исследования, какие задачи кроме диагностических они позволяют решать, что влияет на сроки их выполнения рассказывает заведующая патологоанатомическим отделением с прозектурой НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова, к.м.н. Анна Сергеевна Артемьева.

Что служит материалом для патоморфологических (гистологических) исследований?

Процесс получения фрагмента ткани (биоптата) — биопсия – это несколько разных способов забора материала для гистологического исследования.

Биопсию внутренних органов делают под УЗИ-навигацией, либо с помощью хирургического вмешательства.

Как обрабатывают эти материалы для проведения гистологического исследования?

1 Этап. Фиксация — «консервирование» биоптата в формалине — специальном химическом растворе, который предотвращает гниение, позволяет сохранить структуры ткани.

Фиксация биоптата может занимать от 6 до 24 часов – в зависимости от его вида и размера.

Операционный материал фиксируется дольше, в несколько этапов. Сначала предварительная фиксация, которая занимает примерно 12 часов. Затем вырезка нужных фрагментов и повторная фиксация еще 24 часа.

Соотношение объема материала к объему формалина должно быть 1:20.

2 Этап. Процессинг — процесс обезвоживания, обезжиривания и пропитки материала парафином. Автомат перемещает кусочек материала из раствора в раствор.

В качестве растворов применяются: абсолютированный изопропиловый спирт (6-8 смен), ксилол (2 смены), расплавленный парафин (2 смены).

Программа разнится для «жирного» материала (к которым относятся, например, ткани молочной железы) и «нежирного» – 36 и 24 часа соответственно.

Процесс получения парафиновых блоков.

3 Этап. Изготовление парафинового блока. Кусок материала помещается в форму с расплавленным парафином (уже другим нежели во время процессинга – с более высокой температурой плавления) и охлаждается. Выполняется вручную, сложно ускорить.

4 Этап. Изготовление срезов. Толщина образца — кусочка ткани, залитого в парафин – 1-3 мм. Толщина каждого среза 4-5 мкм (0,004-0,005 мм). Выполняет лаборант с использованием специального инструмента – микротома.

Срезы монтируются на стекла и должны высохнуть.

Несмотря на то, что часть материала теряется при выравнивании в микротоме, при должном профессионализме, из одного образца — материала от одной биопсии, операционного материала от одной опухоли, возможно изготовить около 100 стекол (микропрепаратов).

Для чего делаются срезы?

Срезы делаются для рутинной окраски гематоксилинном и эозином, иммуногистохимического исследования и других видов исследований.

Срезы для всех исследований используются одинаковые, различается окраска, могут отличаться стекла, на которые они монтируются, так для ИГХ и FISH нужны специальные адгезивные стекла или заряженные стекла.

Блоки и стекла способны храниться долгие годы и использоваться для проведения дополнительных гистологических исследований, пересмотров, а также в научных целях.

Архив гистологических материалов собирается в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова с 1927 года и содержит более 10 млн единиц хранения (микропрепараты — стекла, парафиновые блоки, архивные карточки, влажный архив).

Какие виды гистологических исследований наиболее информативны?

Что позволяют определить разные виды гистологических исследований

Гистологическое исследование – что это такое?

Позволяет верифицировать опухоль – то есть определить из каких клеток она состоит (из какой ткани она развивается), степень ее дифференцировки (зрелости).

Рутинная окраска, выполняющаяся при гистологическом исследовании, позволяет выявить патологический процесс в анализируемом материале (биоптате, операционном материале):

Также, в большинстве случаев, благодаря рутинной окраске, можно определить степень злокачественности опухоли и, если она достаточно зрелая, то какова ее природа.

Окрашенные срезы под микроскопом

Инвазивный протоковый рак er 100%.

Карцинома сигмовидной кишки.

Крупноклеточная нейроэндокринная опухоль.

МТС крупноклеточной нейроэндокринной опухоли.

Неспецифический рак молочной железы. Участок in situ карциномы внутри протока, криброзного типа.

Низкодифферинцированный рак пищевода.

При гистологическом исследовании биоптата и операционного материала можно оценить распространенность: размер опухоли и прорастание в окружающие ткани, насколько затронуты лимфоузлы и есть ли метастазы в отдаленные органы (если эти все структуры присланы для гистологического исследования). При консультации готовых микропрепаратов – стекол, это, как правило, невозможно, если опухоль больше размеров гистологической кассеты или рассечена предыдущим исследователем и не предоставлены данные макроскопического исследования.

Во время гистологического исследования изучаются все стекла от одного образца – материала, полученного от одного вмешательства — одной операции или одной биопсии, вне зависимости от их количества, это считается одной консультацией.

Сроки выполнения гистологического исследования зависят от количества микропрепаратов и от категории сложности того процесса, который в них обнаруживается, сроки могут удлиняться, особенно при необходимости использования дополнительных методов исследования и анализа дополнительных сведений. На сроки выполнения гистологического исследования влияет полнота предоставленной пациентом клинической информации, в том числе данных уже проведенных исследований.

Иммуногистохимия (ИГХ)

Сложное многоэтапное исследование, выполняется после гистологического исследования на том же материале. Опухолевые срезы окрашиваются антителами, которые способны связываться антигенами (белками), которые несут опухолевые клетки. Разные опухолевые клетки несут разные антигены, к каждому из которых подобно ключа к замку подходит антитело.

Один из этапов ИГХ

ИГХ исследование — это комбинаторика. 100% специфичных и чувствительных к какой-то опухоли маркеров не существует, но есть набор антигенов, которые в определенном типе опухоль должны быть и набор тех, которых там быть не должно, таким образом ИГХ-панель строится так чтобы включать несколько антител, которые должны быть позитивны и несколько, которые должны быть негативны. Для разных опухолей различаются эти наборы позитивных/негативных маркеров.

При проведении прогностической ИГХ – выявлении маркеров чувствительности к терапии определяется набор таких маркеров для конкретных опухолей, например, рака молочной железы: рецепторы стероидных гормонов (эстроген, прогестерон), рецептор эпидермального фактора роста (HER2) и индекс пролиферативной активности Ki67 (скорости деления клеток).

Стекла окрашиваются последовательно — различными антителами красятся наборы маркеров в несколько этапов, процесс окраски стекол одним антителом занимает 48 часов.

Таким образом, каждое антитело наносится на отдельный срез ткани, монтированный на отдельное стекло, как правило с соответствующим внешним контролем, количество реакций (используемых антител) и этапов окраски может существенно варьировать в зависимости от конкретной диагностической ситуации, все зависит от индивидуальных особенностей опухоли. Проводится такое количество окрасок, которое необходимо для того, чтобы выявить наиболее характерный для определенной опухоли набор позитивных и негативных маркеров.

Кому-то для этого будет достаточно 5 антител, а кому-то необходимо сделать 20 окрасок и более. Максимальное количество окрасок, которое нам приходилось делать – 212.

Поэтому точные сроки и стоимость этого исследования невозможно определить заранее. Разные по течению и прогнозу опухоли могут быть очень похожи друг на друга, только минимальные различия в окрашивании, с учетом клинических данных и данных других методов обследования, могут позволить установить верный диагноз.

Есть целый ряд доброкачественных опухолей, симулирующих злокачественные, в том числе высокоагрессивные, а некоторые злокачественные высоко дифференцированные опухоли трудно отличить от воспалительных и реактивных процессов. В таких ситуациях только опыт и квалификация патоморфолога, анализ всего комплекса доступной информации (снимки КТ, МРТ, рентген, протокол операции, и др.) позволяют поставить диагноз.

В грамотной интерпретации результатов ИГХ очень важна роль эксперта, ведь те случаи, с которыми приходится работать, в большинстве своем, сложные. Практически не существует антител, которые могут выступать в качестве 100%-х маркеров той или иной опухоли, врачу всегда приходится взвешивать различные вероятности.

Что определяется с помощью ИГХ?

Иммуногистохимия позволяет оценить потенциальный темп роста опухоли, ответ на химио-, таргетную, гормональную терапию.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH-тест)

Это метод молекулярно-генетической диагностики в ткани.

FISH проводится в срезе ткани и позволяет привязать генетическую перестройку к конкретной опухолевой клетке.

В этом тесте также используются специальные красители, которые связываются только с определенными участками хромосом. Их называют зондами, которые могут быть помечены флуоресцентным или хромогенным красителем, визуализирующимися при помощи флуоресцентного или светового микроскопа.

Технические операции по подготовке гистологических стекол к этому исследованию занимает 2 рабочих дня.

Анализ препарата с помощью многоголового микроскопа.

Полученные микропрепараты очень чувствительны к внешней среде – они могут выцвести со временем, чтобы избежать потерь информации все FISH-препараты сканируются, создается их цифровая копия, которая доступна для внешнего пересмотра. Специалисты просматривают флуоресцирующий материал в темном поле, в анализе препарата принимают участие как минимум 2 специалиста. При необходимости используется и цифровой анализ.

Что определяется с помощью FISH-теста?

FISH-тест позволят диагностировать некоторые виды опухолей, определяет целесообразность использования некоторых химиотерапевтических препаратов.

Проведение гистологического исследования, и в первую очередь FISH-теста — это экспертная работа, которая зависит от квалификации специалиста. Очень многие мутации, которые выявляются в опухолях, не всегда являются метками опухолей, они могут находиться и в доброкачественных образованиях или нормальных тканях.

За год патологоанатомическое отделение НМИЦ онкологии имени Н.Н. Петрова выполняет около 20000 гистологических исследований (пациентов), из них около 5000 консультативных случаев (пересмотров), более 30000 ИГХ исследований, а также участвует в программе внешнего контроля качества ИГХ исследований NordIQ.

Специалисты отделения обладают огромным опытом проведения гистологических исследований и экспертными компетенциями.

Скорость выполнения гистологических исследований и адекватность гистологического заключения зависят от ряда факторов:

После выполнения гистологического исследования пациент получает гистологическое заключение/протокол исследования гистологического материала.

Расшифровка гистологического исследования: на что обратить внимание?

Гистологическое заключение включает в себя несколько рубрик (полей):

Макроскопическое описание

Заполняется как для биоптатов — не обязательно, так и для операционного материала, для которого имеет крайне важное значение в ряде случаев.

Микроскопическое описание

Описание изменений на микроскопическом уровне, не обязательно к заполнению, так как вся необходимая информация может быть отражена в поле «заключение».

Результаты иммуногистохимического исследования

В этом поле описано какие антитела использовались в данном случае и каков результат окрашивания: наличие окрашивание или его отсутствие, локализация в клетке при необходимости, а также процент позитивных клеток и интенсивность реакции, когда это имеет значение.

Патологоанатомическое заключение

Содержит нозологическую/классификационную единицу, если ее возможно установить по исследованному материалу, то есть дает ответы на вопросы:

Также приводятся все необходимые прогностические данные: степень дифференцировки, параметры, влияющие на стадию, состояние краев резекции, если возможно их оценить и т.п.

Дополнительные замечания и рекомендации

Поле может содержать комментарии, относительно возможного направления дальнейшего обследования, вероятности того или иного диагноза, необходимости ознакомиться с теми или иными клиническими данными и др.

Мы не рекомендуем пациентам самостоятельно заниматься расшифровкой показателей гистологического исследования, используя информацию, полученную на различных Интернет-сайтах и форумах пациентов, так как на интерпретацию данных влияет большое количество факторов, в том числе, возраст пациента, данные других исследований и др.

Расшифровкой исследования может заниматься только специалист – врач онколог по профилю заболевания!

Авторская публикация:
АРТЕМЬЕВА АННА СЕРГЕЕВНА
заведующий патологоанатомического отделения с прозектурой ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, кандидат медицинских наук

Источник

Что такое прямое окрашивание в гистологии

В гистологии, цитологии и эмбриологии существует много методов исследования.

1.1. Световая микроскопия

1.1.1. Устройство микроскопа

оптическая,
осветительная и
механическая.

1. Оптическая система включает объектив и окуляр.

Обычные увеличения объектива:

90 (иммерсионный объектив).

Полный размерПри использовании последнего объектива его следует погрузить в каплю кедрового (иммерсионного) масла, нанесённую на покровное стекло препарата.

б) Окуляр (3) вставляется в тубус сверху. Применяются окуляры с увеличением
7, 10, 15.

20 10 = 200 раз.

формирование увеличенного изображения препарата на сетчатке глаза наблюдателя.

б) Зеркало (5) собирает лучи от источника и направляет их на препарат снизу.

в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей.

г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине.

Они поднимают и опускают тубус для фокусировки изображения объекта на сетчатке глаза наблюдателя.

б) Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости, что позволяет менять участки препарата, попадающие в поле зрения.В итоге, световые лучи проходят следующий путь:

1.1.2. Приготовление гистологического препарата

1.1.2.2. Обезвоживание и уплотнение материала

2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань).

б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле.

3. Заливка : помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин

Дают парафину, остывая, затвердеть;
вырезают из него блок с заключённым образцом и
закрепляют на деревянном кубике.

1.1.2.3. Приготовление срезов

2. а) С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (напр., 10 мкм).

1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду

ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин)

(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.)

2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами

помещают на короткое время в раствор красителя,
промывают водой,
обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и
вновь промывают водой.

4. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или
кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.

1.1.2.5. Мазки и тотальные препараты: особенности приготовления

уплотнение материала и
приготовление среза (с последующим освобождением от уплотнителя).

фиксация,
окраска и
заключение в консервирующую среду.

1.1.3. Методы окрашивания гистологических препаратов

1.1.3.1. Типы красителей

Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.-

Кислые красители

Основные красители

Индифферент-
ные
красители

Существует большое количество различных способов окраски.
Те из них, которые встречаются в нашем курсе, перечислены ниже.

1.1.3.2. Общие методы окраски

б) Сочетает основной и кислый красители.

в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры.

3. Замечание: используемый гематоксилин готовится по методу Эрлиха: окисляется до гематеина калийными квасцами.

2. Окраска железным
гематоксилином
(по методу Генденгайна)

2. Окраска по методу Маллори

1. Краситель является трёхцветным: это смесь

кислого фуксина,
анилинового синего,
оранжевогo G,

а также двух кислот.

2.а ) Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-синий цвет ;

3.Импрегнация
серебром

б) В итоге, выделяющееся серебро осаждается на определённых волокнах соединительной ткани. –

4. Окраска орсеином

Эластические волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-красный цвет ;

5. Окраска
гематоксилин-
пикрофуксином

1. Используется для окраски костей и дентина.

2. а) Предварительно кусочки материала
подвергают декальцинации (с помощью кислоты),
а затем выдерживают в растворе алюмокалиевых квасцов.

1.1.3.4. Окраска клеток соединительной ткани и крови

1. Окраска азур 2 – эозином

Тип красителя	Пример	Окрашиваемые структуры
Кислоты и кислые соли : б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).
Основные с оли : Нейтральные красители	Смесь двух красителей: б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.
1. Препарат предварительно обрабатывают (протравляют) железноаммиачными квасцами, а потом обрабатывают гематоксилином. 2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет. 3. Хорошо выявляются структуры ядра, границы клеток, мышечные волокна. 1.1.3.3. Выявление неклеточных структур соединительной ткани 1. Окраска по методу ван Гизона	Базофильные элементы окрашиваются азуром 2 в тёмно-синий, б) Отличия же от приготовления срезов таковы: фиксацию мазков проводят чистым метанолом ; окрашивание продолжают всего 30-45 мин, а не 12-14 ч; для заключения под покровное стекло используют кедровое масло, а не канадский бальзам. 2. Эритроциты приобретают бледко-красный цвет, цитоплазматические гранулы окрашиваются в зависимости от их природы.

1.1.3.5. Выявление элементов нервной системы

1.Импрегна-
ция
нитратом
серебра1. Особенности предварительной обработки препарата.-

Срез готовят на специальном замораживающем микротоме.

2. При окрашивании срез последовательно обрабатывают растворами

азотнокислого серебра,
формалина,
аммиачного серебра.

2. Окраска
толуидино-
вым синим по методу Ниссля1. Толуидиновый синий окрашивает умеренно базофильные соединения в синий цвет.

2. С его помощью в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются глыбки базофильного вещества (т.н. субстанция Ниссля).

2. а) Как и предыдущий метод, относится к гистохимическим методам исследования.
б) Поэтому подробней описывается ниже.

1.1.4. Гистохимические методы исследования

а) Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата.
б) Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную от окраски исходного реактива.

1а) РНКРеакция Браше.

3. Обычно делают и контрольный препарат, который перед окрашиванием обрабатывают рибонуклеазой.

1б) ДНКРеакция Фёльгена.

2. БелкиИспользуются различные реакции; в том числе:

3а)
ПолисахаридыШИК-реакция.

2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа.

3б)
Гликозамин-
гликаныРеакция с толуидиновым синим.

1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия

— изменение окраски с синей на фиолетовую и красную.

(являющиеся, как известно, гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотных радикалов).

4. Нейтральный
жирРеакция с суданом III (о которой уже упоминалось).

Капли жира в жировой клетке окрашиваются в яркий оранжево-красный цвет благодаря растворению в них красителя.

1.1.5. Просмотр препаратов

1.1.5.1. Срез; окраска гематоксилин-эозином

1. На снимке мы видим внутреннюю поверхность тонкой кишки с находящимися на ней кишечными ворсинками ( 1).

б) Цитоплазма (3) оксифильна и окрашена эозином в розовый цвет.

1. а) Препарат является тотальным.

1.1.5.3. Срез после декальцинации; окраска по Шморлю